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我院原雪峰团队《biology》发文：植物rna病毒突变修复的多层次触发因素，对弱毒疫苗应用的重要提示

2022年7月13日，植物保护学院原雪峰教授领衔的分子植物病毒学研究团队，在国际生物学期刊《biology》在线发表了题为“multiple levels of triggered factors and the obligated requirement of cell-to-cell movement in the mutation repair of cucumber mosaic virus with defects in the trna-like structure”论文。该研究为植物rna病毒分子进化和弱毒疫苗实际应用提供了重要参考，具有重要理论价值和应用借鉴。

rna病毒进化出多种机制维持基因组的稳定性和健康度，如负选择（又称为净化选择）会删除那些因突变严重丧失健康度（fitness）的病毒变体；而病毒特有的低保真度复制酶又会使那些因突变部分丧失健康度的病毒变体通过不同机制趋向回复成野生型，其中rna重组是重要机制之一。解析回复突变的触发因素对于深入了解病毒分子进化至关重要，目前对于突变回复的触发因素研究不够深入。

本研究以三分体病毒-黄瓜花叶病毒cmv为研究对象，对调控病毒复制的核心元件tls（trna-like structure）进行致畸突变，分析其潜在回复突变的触发因素。突变体接种实验显示，不同rna（rna1、rna2和rna3）的tls突变体致病性差异明显，暗示了rna1、rna2和rna3中tls的作用以及调控机制的差异。同时发现，rna1、rna2和rna3的tls突变在高浓度农杆菌（od₆₀₀=1.2）浸润接种时回复突变率有明显差异（0到80%的巨大差异）。同样的tls突变出现差异极大的回复突变率，暗示其回复突变的触发因素不同。northern blot分析发现，tls突变对不同rna的合成存在明显的差异，tls突变几乎不影响rna1相对合成量、显著降低rna2的相对合成量、显著改变rna3及其亚基因组rna4的大小。因此。突变回复的第一层次触发因素为tls突变对相应rna合成的影响程度；造成质变（rna3的大小变化）的回复突变率最高（67-80%），量变（rna2的相对降低）的回复突变率次之（35-46%）。研究表明，tls回复突变的机制为模板依赖型的rna重组。

进一步研究表明，高浓度接种时不发生回复突变的rna1 tls突变体，若混合2b蛋白（cmv编码的基因沉默抑制因子）突变同时接种，则回复突变率为100%。暗示可能是基因组整体复制量的低水平导致回复突变。随后的rna1 tls突变体的梯度稀释接种实验表明，稀释至野生型cmv病毒的稀释限点（od₆₀₀=1.2x10^-4）时，回复突变发生。说明，回复突变的第二层次是初始接种浓度的高低，接近野生型稀释限点的接种浓度容易触发回复突变。

进一步实验表明，不同类型的tls突变体若混合细胞间运动缺陷型rna3同时接种，则回复突变率均为0。无论接种浓度高还是低，只要细胞间运动缺陷型rna3存在，则回复突变无法产生。因此回复突变的第三层次因素是细胞间运动的存在。

本研究揭示了回复突变的三个层次的触发因素，对于植物病毒的分子进化（尤其是弱毒变为强毒）有重要的参考价值。另外，为弱毒疫苗的实际应用提供了重要的借鉴。创制良好的弱毒疫苗时，首先要检测疫苗的稳定性，即排除第一层次的回复突变触发因素；在疫苗实际应用时，则要尽可能避免其他层次的回复突变触发因素。不能低浓度接种弱毒疫苗；另外弱毒疫苗的介体传播特性要突变去除，否则会在介体传播时造成低浓度接种的效果。弱毒疫苗的稀释接种实验印证了这一点，弱毒疫苗（r2-2bpt-1或r2-2bpt-1）在稀释至1.2x10^-3-1.2x10^-4之间时，开始发生突变回复现象，严重影响疫苗的安全性。

本研究第一作者为已毕业博士生刘珊珊（目前在中国农科院烟草所从事博士后研究），二年级硕士生牟金泽提供了弱毒疫苗深度稀释接种后发生突变回复的数据，原雪峰教授为论文通讯作者。本研究得到国家自然科学基金项目（32072382, 31872638）资助。

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